Razvoj in optimizacija izolacije biotehnološko uporabnih molekul iz bakterijskih celic z metodo elektroporacije (2014-2017) |
| Vodja: | prof. dr. Damijan Miklavčič, Fakulteta za elektrotehniko, Univerza v Ljubljani |
| Partner: | dr. Matjaž Peterka, Center odličnosti za biosenzoriko, instrumentacijo in proc. kontrolo (COBIK), Ljubljana |
| Financiranje: | ARRS – Javna agencija za raziskovalno dejavnost RS |
| Šifra: | J7-6783 |
Projekt je financirala Javna agencija za raziskovalno dejavnost Republike Slovenije (ARRS).
- Članica Univerze v Ljubljani
Univerza v Ljubljani, Fakulteta za elektrotehniko
- Šifra
- J7-6783
- Naziv projekta
- Razvoj in optimizacija izolacije biotehnološko uporabnih molekul iz bakterijskih celic z metodo elektroporacije
- Obdobje
- 1.7.2014-30.6.2017
- Letni obseg
- V 2017 0,40 FTE
- Vodja
- Veda
- Interdisciplinarne raziskave
- Sodelujoče RO
- Vsebinski opis projekta
Proteini, proizvedeni v bakterijah, so postali zelo pomembni v industriji in medicini. Uveljavljeni procesi za pridobivanje proteinov (npr. mehanska razgradnja, liza z encimi) pogosto temeljijo na uporabi močne mehanske sile ali kemikalij, kar lahko škoduje strukturi in funkcionalnosti proteinov. Poleg tega popolna razgradnja celice povzroči sproščanje večjih količin ostalih nečistoč, predvsem endotoksinov in genomske DNA (gDNA), zaradi česar so potrebni nadaljnji postopki čiščenja. Posledično stroški čiščenja proteinov v industrijski proizvodnji predstavljajo do 80% proizvodne cene, zato je potrebno razviti nove, bolj učinkovite ekstrakcijske metode in tako zagotoviti cenejše pridobivanje teh molekul iz bakterij.
Elektroporacija je pojav, pri katerem zaradi izpostavitve celice dovolj visokemu električnemu polju pride do strukturnih sprememb v membrani, zaradi česar postane membrana prepustna za molekule, ki sicer ne morejo prehajati skoznjo. V zadnjem času se elektroporacija uveljavlja tudi kot ekstrakcijska metoda za različne molekule iz mikroorganizmov.
V predlaganem projektu smo raziskali možnost razvoja učinkovite metode za ekstrakcijo proteinov iz bakterij (ekstrakcija z elektroporacijo) in s tem omogočili možnost zmanjšanja stroškov proizvodnje ob minimalnih investicijskih stroških. Zaradi neuporabe škodljivih kemikalij, je tudi bistveno manjši vpliv na okolje. Preučevali smo najpomembnejše dejavnike, ki lahko vplivajo na ekstrakcijski proces: parametre električnih pulzov (amplituda, trajanje, število pulzov, ter njihovo ponavljalno frekvenco), fazo rasti bakterij in temperaturo med dovajanjem pulzov, ter po njem. Našo metodo smo primerjali z mehansko razgradnjo s steklenimi kroglicami in sonifikacijo. Glavne pričakovane prednosti predlagane metode so predvsem nižja koncentracija nečistoč (predvsem gDNA), krajši postopek ekstrakcije (prej, kot v sekundi), manjši volumen lizata, neuporaba toksičnih kemikalij in možnost vgradnje v obstoječo proizvodno linijo ob nizki investicijski ceni.
Razvili smo elektroporator električnih pulzov, ki neprekinjeno dovaja električne pulze in pretočno elektroporacijsko komoro ter določili optimalni položaj elektrod in med elektrodne razdalje za učinkovito ekstrakcijo proteinov z elektroporacijo v pretočnem sistemu in s tem dosegli četrto stopnjo tehnološke pripravljenosti.
Cilji projekta so bili: (1) vzpostaviti in optimizirati eksperimentalni protokol za ekstrakcijo proteinov z elektroporacijo iz bakterij v šaržnem sistemu, (2) vzpostaviti in optimizirati eksperimentalni protokol za ekstrakcijo proteinov iz bakterij v pretočnem sistemu na laboratorijskem nivoju in (3) primerjati ekstrakcijo proteinov z elektroporacijo z mehansko razgradnjo s steklenimi kroglicami in sonifikacijo v smislu količine proteinov, prisotnosti endotoksinov in gDNA, cene in trajanja ekstrakcije.
- Sestava projektne skupine
- Karel Flisar (02204): 2014-2016
- Saša Haberl Meglič (29041): 2014-2017
- Nikolaja Janež (33406): 2014-2017
- Tadej Kotnik (15675): 2014-2017
- Damijan Miklavčič (10268): 2014-2017
- Nataša Pavšelj (20822). 2014-2016
- Matjaž Peterka (16327): 2014-2017
- Urška Zelenko (32914): od 2016
- Barbara Zorec (34299): od 2016
- Faze projekta in njihova realizacija
DS1
V prvem delovnem sklopu predlaganega projekta smo se najprej osredotočili na to, v kolikšni meri vplivajo parametri električnih pulzov na ekstrakcijo molekul glede na velikost. E. coli smo izpostavili različnim električnim pulzom (različno število, trajanje, amplituda in ponavljalna frekvenca) s pomočjo elektroporatorja in ugotavljali katere molekule smo ekstrahirali z določenim parametrom električnih pulzov.
Rezultati so opisani v:
- konferenčnem prispevku z naslovom “Extraction by means of electroporation of biotechnologically relevant molecules from bacterial cells”, avtor Haberl Meglič S. na mednarodni konferenci »Mipro 2014«.
- konferenčnem prispevku z naslovom “Electroextraction of large biomolecules is efficient but underestimated in protein and DNA production”, avtorji Peterka M, Janež N, Haberl Meglič S, Miklavčič D. na mednarodni konferenci »2nd World Congress on Electroporation and Pulsed Electric Fields in Biology, Medicine and Food & Environmental Technologies 2017«.
- patentni vlogi »A method for isolation of plasmin DNA (PDNA) from cell cultures«, patent : PCT/EP2014/050084, avtorji Peterka M, Jarc M, Štrancar A, Haberl Meglič S, Miklavčič D.
V drugem delu DS1 smo se osredotočili na ekstrakcijo proteinov iz E. coli z elektroporacijo v šaržnem sistemu. Za to, da smo lahko dosegli sočasno ekstrakcijo proteinov in ohranili celice žive smo optimizirali električne pulze, temperaturo in bakterijsko fazo rasti. Ugotovili smo, da so za pridobitev višje količine proteinov in doseganje nizke umrljivosti bakterij najbolj primerni dalj trajajoči električni pulzi (1 ms) z nižjo amplitudo (5 kV/cm) in 4°C pri stacionarni rasti bakterij.
Rezultati so opisani v:
- diplomski nalogi z naslovom “Influence of electric pulse parameters on electroextraction of proteins from E.coli”, 2014, študenta Marolt T.
- konferenčnem prispevku z naslovom “Protein extraction by means of electroporation and bacterial viability of E. coli”, avtorji Haberl Meglič S, Marolt T, Miklavčič D. na mednarodni konferenci »16th European Congress on Biotechnology 2014«.
- konferenčnem prispevku z naslovom “Protein extraction by means of electroporation and bacterial viability of E. coli”, avtorji Haberl Meglič S, Marolt T, Miklavčič D. na mednarodni šoli »2nd PEF School 2015«.
- članku: Haberl Meglič S, Marolt T, Miklavčič D. Protein extraction by means of electroporation from E. coli with preserved viability, The journal of membrane biology, 248:893-901, 2015.
- konferenčnem prispevku z naslovom “The effect of temperature on protein extraction by electroporation and on bacterial viability, avtorji Haberl Meglič S, Levičnik E, Luengo E, Raso J, Miklavčič D. na mednarodni konferenci »1nd World Congress on Electroporation and Pulsed Electric Fields in Biology, Medicine and Food & Environmental Technologies 2015«.
- konferenčnem prispevku z naslovom “The effect of temperature and growth phase on protein extraction from bacterial cells by means of electroporation”, avtorji Haberl Meglič S, Levičnik E, Miklavčič D. na mednarodni konferenci »30th EFFOST International Conference 2016«.
- vabljenem predavanju z naslovom “Optimization of electroporation protocol for extracting proteins and plasmid DNA from E. coli”, avtor Haberl Meglič S. na mednarodni konferenci »XXIII International Symposium on Bioelectrochemistry and Bioenergetics 2015«.
- članku: Haberl Meglič S, Levičnik E, Luengo E, Raso J, Miklavčič D. The effect of temperature and bacterial growth phase on protein extraction by means of electroporation, Bioelectrochemistry, 112:77-82, 2016.
DS2
V DS2 smo najprej razvili pretočni sistem na laboratorijskem nivoju za ekstrakcijo proteinov z elektroporacijo. Razvili smo elektroporator, ki neprekinjeno dovaja električne pulze in primerno komoro.
Rezultati so opisani v:
- članku: Flisar K, Haberl Meglič S, Morelj J, Golob J, Miklavčič D. Testing a prototype pulse generator for a continuous flow system and its use for E. coli inactivation and microalgae lipid extraction, Bioelectrochemistry, 100:44-51, 2014.
- doktorski disertaciji Flisar K. “High energy device for reversible and irreversible electroporation of the cell membrane”, 2017.
V drugem delu DS2 smo določali optimalno temperaturo pri ekstrakciji proteinov z elektroporacijo v pretočnem sistemu. Ugotovili smo, da temperatura nima večjega vpliva na ekstrakcijo proteinov. Rešitev bi lahko bila segrevanje oz. ohlajevanje celotnega sistema cevi, da preprečimo ohlajevanje/segrevanje bakterij pred vstopom v elektroporacijsko komoro.
Rezultati so opisani v:
- konferenčnem prispevku z naslovom “The influence of temperature on protein extraction from E. coli in a flow through system”, avtorji Haberl Meglič S, Levičnik E, Flisar K, Miklavčič D. na mednarodni šoli »3rd PEF School 2016«.
DS3
V tretjem delovnem sklopu projekta smo primerjali ekstrakcijo z elektroporacijo z mehansko razgradnjo (obdelava s steklenimi kroglicami in sonifikacijo) za pridobivanje proteinov. Primerjali smo prisotnost nečistoč (endotoksinov, gDNA), ceno in čas potreben za ekstrakcijo proteinov. Ugotovili smo, da pri zgodnji logaritemski fazi rasti bakterij in temperaturi 37°C pridobimo največ proteinov in hkrati najmanj endotoksinov in gDNA.
Pri primerjavi metod (ekstrakcija z elektroporacijo, obdelava s steklenimi kroglicami, sonifikacija) smo ugotovili, da je najmanj nečistoč (predvsem gDNA) prisotnih pri metodi ekstrakcije z elektroporacijo.
Rezultati so opisani v:
- članku: Kotnik T, Frey W, Sack M, Haberl Meglič S, Peterka M, Miklavčič D. Electroporation-based applications in biotechnology, Trends in biotechnology, 33:480-488, 2015
- knjižnem poglavju: Haberl Meglič S, Kotnik T. Electroporation-based applications in biotechnology, Handbook of electroporation, Springer, pp.1-17, 2016.
- knjižnem poglavju: Haberl Meglič S. Pulsed electric fields-assisted extraction of molecules from bacterial and yeast cells, Handbook of electroporation, Springer, pp.1-19, 2016.
- konferenčnem prispevku z naslovom “Comparing two methods for protein extraction from bacterial cells-electroporation and glass bead homogenization”, avtorji Haberl Meglič S, Miklavčič D. na mednarodni konferenci »2nd World Congress on Electroporation and Pulsed Electric Fields in Biology, Medicine and Food & Environmental Technologies 2017«.
- Bibliografske reference