Vpliv visokonapetostnih električnih pulzov na membranske proteine pri elektroporaciji

Vpliv visokonapetostnih električnih pulzov na membranske proteine pri elektroporaciji (2020-2023)
Vodja: doc. dr. Lea Rems, Univerza v Ljubljani, Fakulteta za elektrotehniko
Partner: /
Financiranje: ARRS – Javna agencija za raziskovalno dejavnost RS
Šifra: J2-2503

 

Projekt financira Javna agencija za raziskovalno dejavnost Republike Slovenije (ARRS).

Članica Univerze v Ljubljani

Univerza v Ljubljani, Fakulteta za elektrotehniko

Šifra
J2-2503
Naziv projekta
Vpliv visokonapetostnih električnih pulzov na membranske proteine pri elektroporaciji
Obdobje
01.09.2020 - 31.08.2023
Letni obseg
0,7 FTE
Vodja

Doc. dr. Lea Rems

Veda
Tehnika - Sistemi in kibernetika
Sodelujoče RO

Univerza v Ljubljani, Fakulteta za elektrotehniko

Vsebinski opis projekta

Visokonapetostni električni pulzi se vse pogosteje uporabljajo v medicini, biotehnologiji in prehrambni tehnologiji, za doseganje začasnega povečanja prepustnosti membran bioloških celic. Električno polje sproži pojav, imenovan elektroporacija (ali elektropermeabilizacija), pri katerem v celični membrani nastanejo nanoskopske pore, ki omogočajo boljšo izmenjavo zunajceličnih in znotrajceličnih molekul. Večina terapij, ki temeljijo na elektroporaciji, neposredno ali posredno cilja na mišične in živčne celice. To so vzdražne celice, ki lahko generirajo in oddajajo električne signale, imenovane akcijski potenciali. Vzdražnost omogočajo specializirani membranski proteini, predvsem napetostni ionski kanalčki, ki se odpirajo ali zapirajo ob spremembah transmembranske napetosti, ter drugi ionski kanalčki in črpalke, ki uravnavajo generiranje akcijskega potenciala in poznejšo obnovo mirovnega potenciala. Čedalje več eksperimentalnih rezultatov kaže, da lahko visokonapetostni električni pulzi vplivajo na napetostne ionske kanalčke. Vendar je to področje slabo raziskano in pušča odprta vprašanja, kot so: Kako električni pulzi vplivajo na napetostne kanalčke na molekularni ravni? Pod kakšnim razponom parametrov pulzov pride do sprememb v strukturi in funkciji kanalčkov? Kakšne so posledice teh sprememb?

Vse večji interes za uporabo visokonapetostnih električnih pulzov za vnos DNK v mišične in nevronske celice ter za ablacijo srčne mišice in možganskih tumorjev z ireverzibilno elektroporacijo zahteva poglobljene raziskave, ki bodo raziskale kako električni pulzi vplivajo na ionske kanalčke in kakšno vlogo imajo ti vplivi pri izidu zdravljenja. V tem projektu bomo razvili razumevanje kako se napetostni ionski kanalčki odzovejo na izpostavitev visokonapetostnim električnim pulzom na molekularni ravni in kako prispevajo k večji prepustnosti membrane ter drugim učinkom, povezanih z elektroporacijo. To bomo storili na sistematičen način, ki bo združeval računalniške simulacije in eksperimente z biološkimi celicami, oblikovanimi z genskim inženiringom. Z uporabo atomističnih in grobozrnatih simulacij molekularne dinamike bomo napovedali in raziskali elektrokonformacijske spremembe posameznih ionskih kanalčkov ter spremembe v interakcijah med različnimi kanalčki ter interakcije med kanalčki in lipidi v celični membrani. Raziskali bomo sposobnost celice, da ustvari akcijski potencial pri različnih parametrih električnih pulzov, z uporabo celične linije, ki izraža minimalni komplement natrijevih in kalijevih kanalčkov, ki je potreben za generacijo akcijskega potenciala. Ker pri uporabi elektroporacije za različne namene uporabljamo različne parametre električnih pulzov, bomo pri raziskavi dali poseben poudarek na vpliv teh parametrov.

Rezultati našega projekta bodo zelo pomembni za terapije, ki temeljijo na elektroporaciji in ciljajo vzdražne celice, vključno z gensko terapijo, DNA cepivi, ablacijo srčne mišice za zdravljenje aritmij in ablacijo možganskih tumorjev. Rezultati bodo pomembni tudi za druga zdravljenja, pri katerih je elektroporacija vzdražnih celic neželen stranski učinek, na primer pri elektrokemoterapiji in ireverzibilni elektroporaciji različnih tumorjev. Rezultati bodo nadalje pomembni za uporabo elektroporacije pri nevzdražnih celicah, ki izražajo napetostne kanalčke, vključno z rakavimi celicami in matičnimi celicami. Nenazadnje bo ta projekt pomemben tudi s stališča temeljnih biofizikalnih raziskav, saj bo razvil razumevanje, kako lahko zunanja električna polja modulirajo delovanje različnih membranskih proteinov.

Sestava projektne skupine

Link na SICRIS.

Faze projekta in njihova realizacija

Prvi cilj tega projekta je z uporabo atomističnih in grobozrnatih simulacij molekularne dinamike predvideti in raziskati elektrokonformacijske spremembe posameznih napetostnih ionskih kanalčkov ter sprememb v interakciji med proteini in lipidi, ki jih lahko povzročijo električni pulzi. Ta cilj bomo skušali doseči v delovnem paketu DP1. Molekularna dinamika (MD) je računalniška simulacija, ki lahko zajame najrazličnejše pomembne biomolekularne procese, vključno s konformacijsko spremembo in zlaganjem proteinov pri časovni ločljivosti femtosekund. Pomembno je, da takšne simulacije lahko tudi napovedujejo, kako se bodo biomolekule odzvale na perturbacije kot je izpostavitev zunanjemu električnimu polju. Pozornost bomo usmerili predvsem na kanalčke, ki so pomembni za poskuse v DP2. To vključuje srčne natrijeve kanalčke Nav1.5 in kalijeve kanalčke Kir2.1. Hkrati pa bomo v raziskavo vključili tudi druge membranske, kot so napetostni kalcijevi kanalčki, veliki kalijevi kanalčki ter TRPM8 kanalčki, za katere za katere so prejšnje ekspermentalne študije pokazale vpliv pulzov. Z zbiranjem rezultatov simulacij na različnih ionskih kanalčkih želimo določiti skupne biofizikalne značilnosti proteinov, zaradi katerih so le-ti dovzetni za elektrokonformacijske spremembe. Če lahko določimo povezavo med strukturo proteina in dovzetnostjo proteina za elektrokonformacijske spremembe, bo to drastično poenostavilo prepoznavanje membranskih proteinov, ki so tarča električnih pulzov. Atomistične simulacije bodo zagotovile informacije o elektrokonformacijskih spremembah, ki jih lahko povzročijo električni pulzi v posameznih ionskih kanalčkih. Grobozrnate simulacije pa nam bodo omogočile raziskovanje učinkov električnih pulzov na organizacijo membrane ter interakcijo med proteini in lipidi.

Drugi cilj projekta, ki ga bomo skušali doseči v delovnem paketu DP2, je raziskati sposobnost celice, da ustvari akcijski potencial pri različnih parametrih električnih pulzov z uporabo celične linije, ki izraža minimalni komplement natrijevih in kalijevih napetostnih kanalčkov, ki je potreben za generacijo akcijskega potenciala. V ta namen bomo uporabili OS-HEK celice, ki izražajo dve podvrsti natrijevih in kalijevih kanalčkov, Nav1.5 in Kir2.1, ki skupaj celici omogočata proženje akcijskih potencialov. Celice OS-HEK bomo izpostavili električnim pulzom z različnim trajanjem (10 ns – 10 ms) in jakostjo in preverili ali dani pulzi sprožijo akcijski potencial. Opazovali bomo tudi permeabilizacijo in depolarizacijo membrane po pulzu. S temi poskusi bomo določili mejne jakosti električnega polja za vzdraženje in elektroporacijo, ter njihovo odvisnost od trajanja pulza ter polarnosti pulza. Poleg tega bomo s primerjavo odziva celic OS-HEK in običajnih celic HEK, ki ne izražajo ionskih kanalčkov, raziskali vpliv prisotnosti ionskih kanalčkov na elektroporacijo membrane. S pomočjo rezultatov poskusov pa bomo skušali razviti in validirati teoretični model elektroporacije vzdražne celice.

Drugi cilj projekta, ki ga bomo skušali doseči v delovnem paketu DP2, je raziskati sposobnost celice, da ustvari akcijski potencial pri različnih parametrih električnih pulzov z uporabo celične linije, ki izraža minimalni komplement natrijevih in kalijevih napetostnih kanalčkov, ki je potreben za generacijo akcijskega potenciala. V ta namen bomo uporabili OS-HEK celice, ki izražajo dve podvrsti natrijevih in kalijevih kanalčkov, Nav1.5 in Kir2.1, ki skupaj celici omogočata proženje akcijskih potencialov. Celice OS-HEK bomo izpostavili električnim pulzom z različnim trajanjem (10 ns – 10 ms) in jakostjo in preverili ali dani pulzi sprožijo akcijski potencial. Opazovali bomo tudi permeabilizacijo in depolarizacijo membrane po pulzu. S temi poskusi bomo določili mejne jakosti električnega polja za vzdraženje in elektroporacijo, ter njihovo odvisnost od trajanja pulza ter polarnosti pulza. Poleg tega bomo s primerjavo odziva celic OS-HEK in običajnih celic HEK, ki ne izražajo ionskih kanalčkov, raziskali vpliv prisotnosti ionskih kanalčkov na elektroporacijo membrane. S pomočjo rezultatov poskusov pa bomo skušali razviti in validirati teoretični model elektroporacije vzdražne celice.

Bibliografske reference

Link na SICRIS.