Elektroporacija kot metoda za vnos funkcionalnih membranskih proteinov v celice sesalcev brez uporabe genske manipulacije (2015-2017)

   Elektroporacija kot metoda za vnos funkcionalnih membranskih proteinov v celice sesalcev brez uporabe genske manipulacije (2015-2017)
Avstrijski partner: Prof. Eva-Kathrin Sinner, Institute for Synthetic Bioarchitectures, University of Natural Resources and Life Sciences, Vienna, Austria
Slovenski partner: Prof. Damijan Miklavcic, Faculty of Electrical Eng., University of Ljubljana
Financiranje: Austrian Science Fund (FWF), Austria in Agencija za raziskovalno dejavnost Republike Slovenije (ARRS), Slovenija
Šifra: N2-0027

 

Projekt je sofinancirala Javna agencija za raziskovalno dejavnost Republike Slovenije (ARRS).

Članica Univerze v Ljubljani

Univerza v Ljubljani, Fakulteta za elektrotehniko

Šifra
N2-0027
Naziv projekta
Elektroporacija kot metoda za vnos funkcionalnih membranskih proteinov v celice sesalcev brez uporabe genske manipulacije
Obdobje
1.1.2015 – 31.12.2017
Letni obseg
1,62 FTE
Vodja

Damijan Miklavčič

Veda
2.06.07 Tehnika / Sistemi in kibernetika / Biomedicinska tehnika
Sodelujoče RO

Link na SICRIS

Vsebinski opis projekta

Genska transfekcija je pogosto uporabljena metoda v celični biologiji, pri kateri z vnosom genskega materiala v celice dosežemo, da celice pridobijo novo funkcijo in začnejo proizvajati določen želeni protein. Če se genski material vgradi v gostiteljski genom, je izraženost proteina stabilna in dolgotrajna, v nasprotnem primeru pa celica proizvaja protein le dokler genski material ostane nepoškodovan znotraj celice. Tako stabilno kot prehodno transfekcijo pa se običajno nadzoruje z močnim promotorjem, ki zagotovi visok donos proteinov. To prisili celice, da preusmerijo svoje metabolne procese in zaloge energije v proizvodnjo novega proteina. Rezultat je izčrpanost ali celo smrt celic, če so energetske zahteve prekomerne. Dodatni izziv genske transfekcije, ki predstavlja težavo tudi pri genskih terapijah (zdravljenjih, ki temeljijo na genski transfekciji), pa je dejstvo, da celotnega procesa ne moremo povsem nadzorovati.
Kot alternativo genski transfekciji lahko predhodno pripravljene proteine vnesemo kar neposredno v celico. Na ta način preprečimo, da bi celica morala porabljati svojo energijo za samo proizvodnjo proteina, hkrati pa se izognemo tudi potrebi, da bi celica morala pravilno prepoznati zapis vnesenega genskega materiala. Za neposredni vnos proteinov v celice je bilo razvitih že več različnih metod, med drugim mikroinjeciranje, osmotični stres in tripsinizacija. Kompleksnejši problem pa predstavlja dostava membranskih proteinov v celično membrano. Funkcije membranskih proteinov so zelo specifične in so ključnega pomena za normalno delovanje celic. Tako sta njihova odsotnost ali nepravilno delovanje povezana s številnimi boleznimi, med drugim diabetesom, Alzheimerjevo in Parkinsonovo boleznijo. Prav tako sta z membranskimi proteini in mehanizmi, ki njihovo delovanje uravnavajo, povezana tudi delitev in metastatični potencial rakavih celic. S tem torej ni presenetljivo, da so membranski proteini tarča več kot polovice farmacevtskih izdelkov.

Dostava membranskih proteinov v celično membrano, ki ne temelji na genski transfekciji, torej predstavlja pomemben in zanimiv izziv.
V projektu predlagamo razvoj metode za dostavo membranskih proteinov z uporabo elektroporacije namesto genske transfekcije. Metoda zajema tri napredne tehnologije, ki se trenutno uporabljajo na področju sintetične biologije: (i) in vitro sintezo proteinov; (ii) uporabo polimerov za gradnjo membranskih struktur, v katere se proteini vgradijo in zvijejo v končno strukturo; ter (iii) uporabo elektroporacije za zlivanje polimernih membran s celičnimi membranami. Naš cilj je torej dostaviti funkcionalne membranske proteine, predhodno vgrajene v polimerne membrane, kot implante v celično membrano preko zlivanja polimerne membrane s celično.
Za sintezo takšnih implantov so partnerji z Dunaja razvili novo strategijo, tj. sintezo membranskih proteinov v membranskih strukturah brez uporabe živih celic. Membranske strukture obsegajo fosfolipidne vezikle (liposome) ali vezikle zgrajene iz amfifilnih blok-kopolimerov (polimerosome), pri čemer ima uporaba polimerosomov določeno prednost. Uporaba dobro okarakteriziranih polimerov namreč omogoča prilagajanje fizikalnih in kemijskih lastnosti polimerosomov v širokem razponu. V prisotnosti celičnega lizata, ki vsebuje ustrezne ribosome, čaperone, ter druge potrebne elemente za gradnjo in regulacijo, pride do spontane transkripcije DNA z zapisom za želeni membranski protein in končno translacije–sinteze proteina v membranski strukturi.
Zlivanje membran z elektroporacijo pa je uveljavljena metoda, ki temelji na uporabi kratkih visoko-napetostnih električnih pulzov. Z elektroporacijo dosežemo začasno povečanje permeabilnosti celične membrane, hkrati pa membrana v stanju povečane permeabilnosti postane tudi fuzogena, torej sposobna zlivanja z drugo membrano. Da dosežemo zlivanje, brez da bi prekomerno poškodovali celico in povzročili njeno smrt, moramo ustrezno prilagoditi število, dolžino in amplitudo električnih pulzov. V ta namen smo za zlivanje pred kratim začeli uporabljati nanosekundne pulze, s katerimi lahko ciljno elektroporiramo membrano zgolj mestu relevantnem za zlivanje, tj. na stiku z drugo membrano. To omogoča zlivanje tudi celic in veziklov, ki se znatno razlikujejo v velikosti, in predstavlja pomembno prednost pri predlagani metodi.
Razvoj predlagane metode bo zajemal zasnovo primernega protokola elektroporacije za zlivanje in nato spremljanje dostavljenih membranskih proteinov ter razumevanje, kaj se z njimi zgodi po dostavi v celično membrano. Po vzpostavitvi primernega protokola bomo v celice P19 (embrionalne celice mišjega teratokarcinoma) dostavili dopaminski receptor D2L (DRD2L) in na podlagi konvencionalnih parametrov celične biologije ugotovili, ali vgradnja proteina vodi do diferenciacije celic P19. DRD2L bo označen tudi z glikoproteinom virusa vezikularnega stomatitisa, kar bo omogočilo, da uspešno modificirane celice izoliramo na podlagi označevanja s fluorescentnimi protitelesi in ločevalnika fluorescenčno označenih celic (FACS).

Sestava projektne skupine

Link na SICRIS

Faze projekta in njihova realizacija

Naloga 1: Priprava različnih polimerosomov (PS) za zlivanje s celicami

V prvi nalogi smo si zastavili dve raziskovalni hipotezi: 1. Pripravimo lahko različne polimerosome, vezikle iz amfifilnih blok-kopolimerov, za detekcijo elektroporacije in zlivanja, in 2. Polimerosome (PS) lahko poriramo z nanosekundnimi električnimi pulzi.

V našem in partnerskem laboratoriju smo optimizirali pripravo PS (velike in orjaške vezikle) iz različno dolgih osnovnih polimernih gradnikov (diblok kopolimeri polibutadien-polietilen oksid), saj zgradba PS vpliva na njihovo stabilnost in poracijo. Pri tem smo uporabili različne metode elektroformacije veziklov (z elektrodami na objektnih stekelcih, na stekelcih z naparjeno prevodno snovjo ITO – indij-kositrov oksid). Polimerosome smo označili z različnimi fluorescentnimi označevalci za opazovanje pod fluorescenčnim mikroskopom: NBD, lisamin rodamin, DNS ali Di-8-ANEPPS smo lahko vgradili v membrano veziklov za ugotavljanje zlivanja s celicami, nekatere PS pa smo napolnili s kalceinom za ugotavljanje oblike in poracije veziklov pod vplivom električnega polja. Z opazovanjem sproščanja kalceina iz veziklov pod fluorescenčnim mikroskopom smo ugotovili, da lahko dosežemo poracijo PS z nanosekundnimi pulzi (nsEP), katerih prednost je v tem, da omogočajo zlivanje celic in veziklov, ki se znatno razlikujejo v velikosti. Ugotovitev, da je možna poracija PS z nsEP, je prvi korak pri zlivanju PS in celic, saj morata biti za zlivanje celic s PS izpolnjena dva pogoja: 1. celice in PS morajo biti v stiku, ter 2. celice in PS morajo biti na mestu stika porirana. Zato smo raziskali poracijo PS pri različnih parametrih pulzov (amplituda, trajanje in število pulzov), saj je za doseganje zlitja celic in PS potrebno najti presek parametrov, kjer se porirajo tako celice kot PS, celice pa morajo pri tem preživeti (elektroporacija mora biti reverzibilna). Ugotovili smo, da se PS, verjetno zaradi svoje stabilnosti in rigidnosti, porirajo pri višjih amplitudah/trajanju/številu pulzov kot celice.

S partnerjem smo se sproti dogovarjali o protokolih priprave, obiski pa so nam omogočili predstavitve in analize novih dognanj, sprotno ugotavljanje bistvenih problemov, ki se pojavljajo pri raziskavah, in iskanje rešitev zanje z optimizacijo raziskovalnih metod in z načrtovanjem novih poskusov. Srečali smo se tudi v okviru Prvega svetovnega kongresa o Elektroporaciji v Portorožu ter mednarodne šole Electroporation-Based Techniques and Treatments v Ljubljani.

  • Batista Napotnik, Tina, Rems, Lea, Bello, Gianluca, Sinner, Eva-Kathrin, Miklavčič, Damijan. Preparing polymersomes and cells for electrofusion. Programme and book of abstracts, 1st World Congress on Electroporation and Pulsed Electric Fields in Biology, Medicine and Food & Environmental Technologies incorporating Bioelectrics. Portorož, Slovenia, 2015, 86, COBISS.SI-ID 11147604
  • Bello, Gianluca, Batista Napotnik, Tina, Rems, Lea, Huber, Christoph, Küpcü, Seta, Angjeli, Belinda, Tan, Cherng-Wen Darren, Miklavčič, Damijan, Sinner, Eva-Kathrin. Electroporation as method for inserting functional membrane proteins in mammalian cells. Programme and book of abstracts, 1st World Congress on Electroporation and Pulsed Electric Fields in Biology, Medicine and Food & Environmental Technologies incorporating Bioelectrics. Portorož, Slovenia, 2015, 63-64, COBISS.SI-ID 11150164
  • Bello, Gianluca, Batista Napotnik, Tina, Rems, Lea, Miklavčič, Damijan, Sinner, Eva-Kathrin. Polymeric membranes in the form of giant lamellar vesicles as possible carrier of functional membrane proteins into viable cells via electrofusion. Proceedings of the Electroporation based technologies and treatments: international scientific workshop and postgraduate course. Ljubljana, Slovenia, 2015, 149, COBISS.SI-ID 11218260

 

Naloga 2: Zlivanje polimerosomov (PS) s celicami

V drugi nalogi smo si zastavili raziskovalno hipotezo: z nanosekundnimi električnimi pulzi lahko dosežemo zlivanje polimerosomov s CHO celicami.

S pomočjo fluorescenčnega barvila Hoechst 33342 smo ugotavljali vpliv električnih pulzov različnih parametrov na zlivanje CHO celic med seboj in ugotovili, da poteka zlivanje pri nižjih pulzih kot poracija PS. Kljub temu pa smo določili presek pulzov, ki bi lahko privedel do poracije tako celic kot PS in tako omogočili zlivanje tistih celic in PS, ki so v tesnem stiku. Vendar pa nam to ni uspelo.

Za zlivanje celic in PS moramo najprej zagotoviti tesen stik med celicami in PS. To smo naredili s dielektroforezo, vendar pa se v verige najprej postavijo celice in šele nato PS, zato verige niso mešane in s tem ne vzpostavimo dovolj veliko stikov med celicami in PS, kar bi lahko bil vzrok za to, da zlivanja nismo dosegli. Pri preučevanju vpliva parametrov nanosekundnih električnih pulzov (nsEP) smo ugotovili, da ponavljalna frekvenca električnih pulzov v kombinaciji z različno prevodnimi raztopinami znotraj in zunaj veziklov vpliva na obliko polimerosomov, podobno kot pri sinusnem električnem polju na liposomih. Pri visoki ponavljalni frekvenci in bolj prevodnem mediju znotraj PS kot zunaj smo dosegli podaljšanje PS v smeri električnega polja, kar bi lahko dodatno povečalo stik celic in PS v verigah in s tem zagotovilo boljše pogoje za zlivanje celic s PS. Kljub pripravi različnih PS v sodelovanju s partnerskim laboratorijem (velikost, dolžina osnovnih gradnikov, različno prevodne raztopine znotraj in zunaj PS), prisotnosti/odsotnost seruma v gojišču, dodajanjem polietilenglikola raztopini PS nismo dosegli zlivanja celic in PS. Zato smo uporabili drugo celično linijo, mišji melanom B16F1, ki se je v preteklosti izkazala za bolj fuzogeno kot CHO. Pri tem smo najprej raziskali, če so PS za to linijo toksični, in ugotovili, da niso toskični niti za B16F1 ne za CHO celice, toda tudi s to linijo nismo uspeli zagotoviti zlivanja s PS.

  • Batista Napotnik, Tina, Bello, Gianluca, Sinner, Eva-Kathrin, Miklavčič, Damijan. The effect of nanosecond, high-voltage electric pulses on the shape and permeability of polymersome GUVs. The Journal of Membrane Biology, 2017, 250, 5, 441-453, COBISS.SI-ID 11785300

Ker nismo uspeli zliti celic s PS, smo bili ves čas v stiku s partnersko raziskovalno skupino in skupaj razmišljali o drugih načinih zniževanja poracijskega praga za PS in vzpostavljanja stikov med celicami, vendar nismo bili uspešni. Verjetno k temu pripomore velika stabilnost in rigidnost PS, saj podolgovata oblika zaradi električnih pulzov z visoko ponavljalno frekvenco ne pripomore k večji poraciji PS. Zaradi uporabe različnih metod detekcije elektroporacije smo tudi napisali pregledni članek o teh metodah, ki bo omogočil raziskovalcem s tega področja olajšati izbiro ustrezne metode za specifične poskuse.

  • Batista Napotnik, Tina, Miklavčič, Damijan. In vitro electroporation detection methods: an overview. Bioelectrochemistry, 2018, 120, 166-182, COBISS.SI-ID 11931476

 

Naloga 3: Dovajanje dopaminskega recptorja D2L v membrane celic s pomočjo zlivanja celic s proteopolimerosomi

V tretji nalogi smo si zastavili naslednjo hipotezo: z zlivanjem celic s polimerosomi z vgrajenim proteinom lahko v celično membrano dovedemo transmembranski protein.

Naloga 2, zliti celice s polimerosomom (PS) brez vgrajenega proteina, ni bila uspešna. Zato smo želeli preizkusiti, ali se celice zlivajo s polimerosomi, ki v svoji membrani nosijo transmembranski protein (proteopolimerosomi). Proteini v membrani vplivajo na lokalno okolje proteina v membrani, kar bi lahko privedlo do lažje poracije in s tem uspešnega zlivanja celic s proteopolimerosomi. V partnerskem laboratoriju se ukvarjajo z in vitro sintezo proteinov in vstavljanjem tako izdelanim proteinov v vezikle. Vendar pri in pripravljanju PS z vgrajenim D2L so imeli težave z vgrajevanjem proteinov v PS, z njihovo orientacijo ter čiščenjem tako pripravljenih proteopolimerosomov. Ti vezikli tako niso bili primerni za poskuse zivanja s celicami.

Bibliografske reference

Link na SICRIS