Začetki

V Laboratoriju za biokibernetiko, ki ga je leta 1963 ustanovil pokojni akademik prof. dr. Lojze Vodovnik, že vseskozi preučujemo interakcije med elektromagnetnimi polji in biološkimi sistemi. To obsega tako raziskovanje učinkov elektromagnetnih polj na organizme kot uporabo elektromagnetnih polj za terapevtske in diagnostične namene.

Do konca sedemdesetih let prejšnjega stoletja je bila naša glavna raziskovalna tema funkcionalna električna stimulacija (FES) za ponovno vzpostavitev motoričnih funkcij, okvarjenih zaradi različnih vrst poškodb in živčno-mišičnih bolezni. Ta pristop so odtlej prevzeli številni rehabilitacijski centri po svetu, na naši fakulteti pa ga še naprej razvijajo v Laboratoriju za robotiko v sodelovanju z Univerzitetnim rehabilitacijskim inštitutom.

Tekoče raziskave

Od osemdesetih let prejšnjega stoletja so se naše raziskave postopoma začele osredotočati na vplive električnih tokov in elektromagnetnih polj na fiziološko stanje celic in tkiv, zlasti na pojav elektroporacije celične membrane ter njegovo uporabo v biologiji, biotehnologiji in medicini 1,2. Čeprav je nastajanje z električnim poljem povzročenih vodnih por v lipidnem dvosloju membrane danes široko sprejet osrednji mehanizem tega pojava, pa je vse jasneje, da k elektroporaciji prispevajo tudi oksidativne spremembe membranskih lipidov in poškodbe membranskih proteinov 3.

Pojav elektroporacije preučujemo tako s teoretičnimi kot z eksperimentalnimi pristopi, ki segajo od atomsko-molekularne ravni (simulacije molekularne dinamike) prek ravni membran (lipidni dvosloji in vezikli), organelov in celic (celice v suspenziji, pritrjene in v 3D kulturah), do tkiv in organov (študije na živalih v sodelovanju z Veterinarsko fakulteto Univerze v Ljubljani in s Sunnybrook Research Institute v Torontu, Kanada). Sodelujemo tudi z medicinskimi ustanovami (Klinični oddelek za kirurgijo srca in ožilja ter Klinični oddelek za kardiologijo Univerzitetnega kliničnega centra Ljubljana, Onkološki inštitut v Ljubljani) pri kliničnih raziskavah ter z nacionalnimi in mednarodnimi industrijskimi partnerji pri razvoju medicinskih in eksperimentalnih naprav. Naše delo tako obsega razvoj naprav, temeljne in translacijske eksperimente ter modeliranje, pa tudi načrtovanje zdravljenja in razvoj informacijskih tehnologij za klinične študije, na področjih od proučevanja osnovnih mehanizmov do aplikacij v onkologiji, kardiologiji, genskem in celičnem zdravljenju ter predelavi hrane in biotehnologiji. Organizacijska shema področij našega dela je prikazana spodaj, podrobnejši opisi našega dela na posameznih področjih pa so dostopni prek povezav na zavihku »Raziskave«.

Naše objave o elektroporaciji in njenih aplikacijah so doslej prejele več kot 30 tisoč citatov. Od leta 2003 organiziramo (sprva vsaki dve leti, od leta 2011 letno) delavnico in podiplomski tečaj Electroporation-Based Technologies and Treatments (EBTT), ki vsako leto privabi več kot 50 udeležencev, skupno pa doslej že več kot 800 udeležencev iz preko 40 držav. Predsedovali smo evropski mreži za razvoj tehnologij in zdravljenj na osnovi elektroporacije – COST Action TD1104 (2011–2016), ki je povezala 581 raziskovalcev elektroporacije z 243 raziskovalnih ustanov in 28 podjetij iz 43 držav. Profesor Damijan Miklavčič, vodja raziskav v laboratoriju, je urednik enciklopedije Handbook of Electroporation pri založbi Springer; prva izdaja je izšla leta 2017 in obsega skoraj 3000 strani, druga, posodobljena in razširjena izdaja pa bo predvidena objavljena leta 2027.

Molekularni mehanizmi elektroporacije

Močno električno polje v membrani poruši zgradbo lipidnega dvosloja, lahko pa tudi kemijsko spremeni membranske lipide in proteine. S tem nastanejo nove poti za transport ionov in molekul preko membrane. Na molekularni ravni elektroporacija vključuje več mehanizmov, ki lahko potekajo sočasno. Ti vključujejo tvorbo začasnih (metastabilnih) vodnih por v lipidnem dvosloju, oksidacijo membranskih lipidov in poškodbe določenih membranskih proteinov, zlasti ionskih kanalov in transporterjev. Oksidacija lipidov in poškodbe membranskih proteinov lahko prav tako vodijo do tvorbe por. Čeprav teh por zaradi njihove majhnosti in metastabilnosti ni mogoče neposredno opazovati s konvencionalno mikroskopijo, je njihov obstoj potrjen s simulacijami molekularne dinamike in posrednimi eksperimentalnimi dokazi. Elektroporacija povzroči tudi spremembe citoskeleta — strukturne mreže znotraj celice, ki je mehansko povezana z membrano in vpliva na kinetiko zapiranja por. Naštete molekularne spremembe skupaj določajo permeabilizacijo membrane in posledični celični odziv. 3

Elektroporacija na tkivni ravni

Elektroporacija v tkivih je kompleksnejša kot v izoliranih celicah. Medsebojna bližina celic in povezave med njimi bistveno vplivajo na porazdelitev vsiljene transmembranske napetosti, ki jo ustvari izpostavitev celic električnemu polju. Transport molekul skozi tkivo je oviran zaradi goste razporeditve celic in komponent zunajceličnega matriksa, ki jih obdaja. Porazdelitev električnega polja v tkivu je inherentno nehomogena zaradi kompleksne geometrije in razlik v električni prevodnosti med komponentami tkiva. Poleg tega elektroporacija med dovajanjem električnih pulzov dinamično spreminja električne lastnosti tkiva: elektroporirana področja postanejo bolj prevodna, kar že med pulzom prerazporeja električno polje. Za razumevanje teh interakcij moramo pri računalniškem modeliranju upoštevati heterogenost tkiva, dinamične spremembe prevodnosti in medsebojni vpliv med porazdelitvijo polja in biološkim odzivom.

Učinki na celično elektrofiziologijo

Nizkonapetostni električni pulzi lahko stimulirajo vzdražne celice in se rutinsko uporabljajo v medicinskih aplikacijah, kot sta stimulacija živcev in elektrostimulacija srca. Vendar elektroporacija močno vpliva na vzdražnost živčnih in mišičnih celic. Ko nastopi elektroporacija, skozi elektroporirane regije tečejo dodatni neselektivni tokovi, kar poruši normalno celično signalizacijo. Že blaga elektroporacija lahko vpliva na nastajanje in širjenje akcijskih potencialov, močnejša elektroporacija pa povzroči trajno depolarizacijo membrane (začasno nezmožnost vzdraženja in krčenja). V mišičnih celicah, kot so kardiomiociti, elektroporacija vpliva tudi na kontrakcijo. Elektroporacija vpliva tudi na elektrofiziologijo nevzdražnih celic in sproži znotrajcelične kalcijeve odzive prek permeabilizacije membrane in aktivacije ionskih kanalov. Ti odzivi lahko vplivajo na celično delitev, diferenciacijo in poti celične smrti, kar je pomembno upoštevati pri zasnovi zdravljenj na osnovi elektroporacije. 3

Uporabe v medicini in biologiji

Elektroporacija je od devetdesetih let prejšnjega stoletja osrednje raziskovalno področje Laboratorija za biokibernetiko. Z leti je področje dozorelo tako v razumevanju fizikalnih in bioloških pojavov, vključenih v njene kompleksne in večplastne učinke na žive celice, tkiva in celotni organizem. Elektroporacijo lahko uporabimo nedestruktivno (reverzibilna elektroporacija) za povečanje ali olajšanje prehajanja različnih snovi skozi celično membrano, ali destruktivno za neposredno povzročitev odmrtja celic (ireverzibilna elektroporacija). Te učinke je mogoče izkoriščati v zelo raznolikih aplikacijah. Na začetku so bile naše raziskave in razvoj usmerjeni predvsem v uporabo elektroporacije za zdravljenje čvrstih tumorjev. Bili smo med pionirji razvoja elektrokemoterapije tumorjev, pri kateri se reverzibilna elektroporacija uporablja za povečanje učinkovitosti kemoterapevtikov. Dodatno področje uporabe reverzibilne elektroporacije je genski elektroprenos (angl. gene electrotransfer – GET), pri katerem se elektroporacija uporabi za vnos dednega materiala v celice za gensko in celično zdravljenje. Ireverzibilna elektroporacija pa se lahko uporablja za ablacijo (uničenje ali odstranitev) nenormalno delujočega tkiva. Ablacija s pulznim električnim poljem (angl. pulsed field ablation – PFA) se tako uporablja za uničevanje tumorjev in pri zdravljenju srčnih aritmij. V zadnjem desetletju se je naša pozornost postopoma preusmerila k uporabi elektroporacije v kardiologiji z namenom razvoja novih pristopov za zdravljenje življenje ogrožajočih aritmij, predvsem atrijske fibrilacije, kjer ablacija s pulznim električnim poljem že začenja izrivati konvencionalne termične metode ablacije. Vznemirljiva zgodba uporabe elektroporacije tako še zdaleč ni končana, saj je obstoječa zdravljenja treba izpopolniti, na obzorju pa so nova tarčna tkiva in bolezni, ki jih bo v prihodnje mogoče (o)zdraviti.