Selektivna elektroporacija s porazdeljenimi nanoelektrodami (2021-2024) |
| Vodja: | prof. dr. Damijan Miklavčič, Univerza v Ljubljani, Fakulteta za elektrotehniko |
| Partner: | / |
| Financiranje: | ARRS – Javna agencija za raziskovalno dejavnost RS |
| Šifra: | J2-3046 |
Projekt financira Javna agencija za raziskovalno dejavnost Republike Slovenije (ARRS).
- Članica Univerze v Ljubljani
- Šifra
- J2-3046
- Naziv projekta
- Selektivna elektroporacija s porazdeljenimi nanoelektrodami
- Obdobje
- 1.10.2021 - 30.9.2024
- Letni obseg
- 1,3 FTE
- Vodja
- Veda
- Tehnika - Sistemi in kibernetika
- Sodelujoče RO
Univerza v Ljubljani, Fakulteta za elektrotehniko
- Vsebinski opis projekta
Elektroporacija postaja široko uporabljena metoda za začasno povečanje prepustnosti celične membrane z izpostavitvijo celice ali tkiva kratkim in visoko napetosntim električnim pulzom. Elektroporacija še posebej dobiva zagon za lokalni vnos kemoterapevtskih zdravil v tumorske celice in za vnos nukleinskih kislin v celice za različne oblike genske terapije. Ena najpomembnejših prednosti elektroporacije je njena univerzalnost, saj jo lahko uporabimo za permeabilizacijo membrane dobesedno katere koli vrste celic. Vendar ta prednost postane pomanjkljivost, ko moramo selektivno elektroporirati določene celice v zapleteni strukturi tkiva.
Cilj projekta je razviti nov pristop, ki bo omogočil selektivno elektroporacijo ciljnih celic za dostavo zdravil in genov. V ta namen bomo uporabili prevodne nanodelce zlata (ND), s katerimi smo pokazali (tudi druge študije), da lahko delujejo kot porazdeljene nanoelektrode in lokalno ojačajo vzpostavljeno električno polje. Pri tem se morajo za izbolšanje elektroporacije membrane ND nahajati v njeni neposredni bližini. Te ND je mogoče tudi funkcionalizirati za interakcijo z membranami določenih celic. Tako domnevamo, da lahko s kombinacijo električnih pulzov s primerno izbranimi ND dosežemo želeno selektivno elektroporacijo.
V okviru tega projekta bomo svojo hipotezo preizkusili s teoretičnimi in eksperimentalnimi pristopi ter združenimi močmi raziskovalcev nanomaterialov, strokovnjakov za celično biologijo in vodilnih svetovnih strokovnjakov za elektroporacijo. Projekt je organiziran v štirih delovnih sklopih (DS). DS1 je namenjen teoretičnemu razumevanju medsebojnih povezav med interakcijami ND s celično membrano, lokalnim ojačanjem električnega polja in elektroporacije. To razumevanje bomo razvili z uporabo našega strokovnega znanja in izkušenj pri simulacijah molekularne dinamike in modeliranju z metodo končnih elementov. Aktivnosti v DS1 so tesno povezane z aktivnostmi DS2, ki je namenjen poskusom in vitro na sistemih z naraščajočo biološko zapletenostjo: ravninski lipidni dvosloj; velikanski mehurčki plazemske membrane; in različne celice in vitro. Ravninski lipidni dvosloj in velikanski mehurčki plazemske membrane bodo odličen modelni sistem za preučevanje interakcije med nanodelci in membrano, saj jih je mogoče uporabiti s preprostimi elektroliti, pri katerih je vedenje funkcionaliziranih ND bolj predvidljivo kot v kompleksnih medijih, potrebnih za gojenje celic. Ti poskusi bodo nadalje omogočili primerjavo s teoretičnim delom v DS1. Uporaba različnih celičnih linij, široko raziskanih celic CHO, normalnih prašičjih urotelijskih celic in celičnih linij človeškega raka mehurja različnega gradusa nam bo z uporabo ND omogočila selektivnost elektroporacije in dovajanja zdravil. Zlate ND bomo raziskovali s sistematičnim spreminjanjem njihovih lastnosti: velikosti (5-50 nm), prevleke (grobe ali gladke) in funkcionalizirano površino. Delo v DS1 in DS2 bo nadgrajeno v DS3, ki je osredotočeno na prikaz transmembranskega transporta, kopičenja zdravil in genske transfekcije v celicah in vitro. Na koncu bomo z aktivnostmi v DS4 zagotovili učinkovito diseminacijo rezultatov projekta ter identifikacijo in zaščito intelektualne lastnine.
Projekt vsebuje številne inovativne in ambiciozne metodološke pristope, ki zahtevajo interdisciplinarno strokovno znanje. Zato bo projekt potekal v sodelovanju med Fakulteto za elektrotehniko in Medicinsko fakulteto Univerze v Ljubljani in Oddelkom za sintezo materialov na Institutu Jožef Stefan v Ljubljani.
Rezultati projekta bodo zagotovili podlago za učinkovitejšo elektroporacijo in selektivno elektroporacijo z uporabo funkcionaliziranih ND. Rezultati projekta bodo zagotovili tudi nov vpogled v interakcije ND s celičnimi membranami, kar zanima širšo znanstveno skupnost.- Sestava projektne skupine
Cilj projekta je sistematično raziskati pojav elektroporacije / permeabilizacije membrane in vnosa zdravil ter nukleinskih kislin (npr. DNA) v celico z uporabo pulznih električnih polj in nanodelcev preko modeliranja (DS1), eksperimentov (DS2) in transmembranskega transporta zdravil in transfekcije celic in vitro (DS3). Kombinacija teorije in eksperimentov bo omogočila sistematično raziskovanje in razumevanje medsebojne interakcije celične membrane z nanodelci in električnim poljem. Posebna skrb bo namenjena diseminaciji rezultatov projekta znanstveni skupnosti po različnih komunikacijskih kanalih ter prepoznavanju in zaščiti intelektualne lastnine (DS4).
V DS1 bomo raziskali interakcijo dvoslojne lipidne membrane z majhnimi (npr. ≤5 nm) zlatimi ND in posledične spremembe celične membrane zaradi bližnjih ND z uporabo molekularne dinamike in interakcije z večjimi ND (20 in 50 nm) z uporabo metode končnih elementov in porazdeljenega ekvivalentnega vezja. Raziskali bomo vpliv parametrov, kot so oblika, velikost in oddaljenost ND od membrane na vsiljeno transmembransko napetost, gostoto por, vzpostavljeno električno polje in porazdelitev naboja znotraj lipidnega dvosloja in njegovo kapacitivnost. Rezultati modelov bodo pripomogli pri izbiri ND v DS2 in bodo uporabljeni za načrtovanje poskusov v DS3 pri poskusu potrditve teoretičnih napovedi z uporabo eksperimentalnih pristopov.
V DS2 bomo oblikovali, sintetizirali, funkcionalizirali in konjugirali natančno definirane zlate ND (Slika 4 in 5). Izbiro in strategijo funkcionalizacij ND za kasnejšo uporabo v eksperimentih v DS3 bomo izvedli na podlagi teoretičnih napovedi in izračunov. Teoretične napovedi in izračune bomo izvedli v DS1. Specifične nanodelce z visokim kontrastom pri elektronski mikroskopiji bomo preučevali po inkubaciji s celicami. Določali bomo razdaljo vezanih ND na celični membrani in debelino membrane. Dobljeni rezultati bodo nato služili za validacijo rezultatov dobljenih v DS1. Rezultati v DS2 bodo skupaj z rezultati dobljenimi v DS3 služili za validacijo modelov razvitih v DS1.
V DS3 bomo proučili elektroporacijo/permeabilizacijo celične membrane, znotrajcelično akumulacijo zdravilnih učinkovin in gensko transfekcijo celic. Omenjene pojave bomo proučevali z in vitro poskusi z uporabo pulzirajočih električnih polj in različnih ND-jev, predstavljenih v DS1 in sintetiziranih ter okarakteriziranih v DS2. Začeli bomo s poskusi na celičnih suspenzijah, ki jim bomo dodali fluorescenčna barvila, ki se rutinsko uporabljajo za določanje permeabilizacije celičnih membran. Nivo permeabilizacije celičnih membran in preživetja celic bomo določali po izpostavitvi celic pulzirajočim električnim poljem ob prisotnosti različnih ND. Po optimizaciji pulznih parametrov, koncentracije ND in pogojev inkubacije bomo v celice dostavili citotoksične molekule in nukleinske kisline (npr. pDNA).
V DS4 bomo zaščitili intelektualno lastnino in dosežene rezultate projekta širili zainteresirani znanstveni skupnosti. Ker je lahko interakcija nanodelcev z membranami in povečana membranska elektroporacija s strani ND-jev zelo zanimiva, bomo posebno pozornost namenili uporabi številnih različnih komunikacijskih kanalov za razširjanje rezultatov projekta, kot so znanstvene publikacije in revije, konference ter kongresi. Rezultati bodo objavljeni v revijah Bioelectrochemistry, IEEE Transactions on Biomedical Engineering, Small, Biomaterials, Nanomedicine in predstavljeni na Svetovnem kongresu o elektroporaciji, na Evropskem mikroskopskem kongresu, in na Mednarodnem mikroskopskem kongresu. Za izmenjavo znanja in strokovnega znanja, povezanega z izboljšanjem permeabilizacije celic z uporabo ND, bomo na Svetovnem kongresu elektroporacije leta 2023 pripravili posebno sekcijo in tečaj usposabljanja v okviru Mednarodne znanstvene delavnice in podiplomskega tečaja Electroporation-based Technologies and Treatments, ki jo organiziramo vsako leto.